构建重组质粒之前为什么先连接t载体,T载体克隆

时间:2022-09-02 02:51       来源: 未知
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
  DNA连接酶有两种:T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。 T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步:首先,T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物;然后,酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化;最后产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
  很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体,载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样,pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对,在连接酶的催化下,就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中,形成含有目的片断的重组载体。
  连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度,即12-16℃,连接12-16h(过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。 LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因,可以编码β—半乳糖核苷酶。β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体,可催化乳糖的水解.用X-Gal为底物进行染色时,呈蓝色。
  一些特定的质粒(比如pUC/pBS等),常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N端146个氨基酸(α肽段)的编码序列,在这个编码序列里还插入一个多克隆位点(MCS),它并不影响lacZ的表达。另外,常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C端部分序列(β肽段),的编码序列。在各自独立的情况下,这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。只有当携带α肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞,在培养基诱导物IPTG的诱导下,载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶N端(α肽段),这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列(β肽段)互补,形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。
  而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后,会造成lacZ基因不能表达,从而不能合成β—半乳糖核苷酶;而对于空载体,lacZ基因正常表达,通过α互补合成β—半乳糖核苷酶,分解培养基里的色素底物X-gal,最终形成蓝色的化合物,出现蓝色菌斑。
  
  

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